L’universo dei Test Genetici

La somma di tutte le informazioni genetiche di un individuo viene chiamata genoma. Da un punto di vista strutturale, il genoma consiste in una lunga catena di DNA (acido desossiribonucleico) avvolta a formare una doppia elica destrorsa e quindi impaccata a costituire i cromosomi. All'interno della lunga catena di DNA sono contenuti dei segmenti chiamati geni, i quali vengono utilizzati come stampo per la produzione di molecole di RNA (una sorta di "fotocopie" delle informazioni contenute nel DNA) utilizzate per trasmettere le informazioni genetiche traducendole in proteine, gli agenti principali responsabili della funzionalità dell'organismo.

Fonte immagine: National Human Genome Research Institute

Ciascuna cellula dell'organismo contiene 23 coppie di cromosomi omologhi (in totale 46), metà di origine materna e metà di origine paterna. Delle 23 coppie di cromosomi, 22 coppie (gli autosomi) vengono identificate tramite una numerazione crescente, da 1 a 22. La restante coppia di cromosomi è composta dai noti cromosomi X e/o Y, ossia i cromosomi sessuali (o eterocromosomi). I cromosomi sessuali contengono tutte le informazioni genetiche necessarie alla determinazione del sesso, inclusi i caratteri primari e secondari; i maschi possiedono un cromosoma X ed un Y (XY) mentre le femmine due cromosomi X (XX) . I cromosomi sono contenuti nel nucleo della cellula. Esistono tuttavia piccoli frammenti di DNA contenuti in altre aree della cellula, esterne al nucleo, come quelli contenuti nei mitocondri, organelli a localizzazione citoplasmatica.

Il materiale genetico (DNA) conservato sotto forma dei cromosomi, è contenuto nel nucleo di tutte le cellule dell’organismo ed è costituito da moltissimi geni. Il genoma umano è costituito approssimativamente da 20.000 geni. Le informazioni contenute al loro interno portano essenzialmente alla produzione di una grande varietà di proteine, i mattoni fondamentali per la costruzione e la funzionalità dell'organismo umano.

Il DNA è costituito da una doppia elica destrorsa, formata da due filamenti complementari; questa caratteristica è alla base della maggior parte delle tecniche utilizzate per l’analisi del DNA. Ciascun filamento di DNA è organizzato in molte sezioni contenenti vari tipi d’informazione genetica, chiamate geni, alternate a regioni così dette “non codificanti” con altre funzioni peculiari. I geni sono composti da una sequenza non casuale di nucleotidi i quali, a loro volta, sono costituiti da uno zucchero pentoso (il desossiribosio, la “D” dell’acronimo DNA) associato ad un gruppo fosfato ed una base azotata. Esistono quattro basi azotate nel DNA: adenina (A) e guanina (G), dette purine, e citosina (C) e timina (T), dette pirimidine. La differente sequenza di queste quattro basi presente su ciascun filamento della doppia elica di DNA, definisce le caratteristiche genetiche peculiari di ciascun individuo. Le purine e le pirimidine sui due filamenti si accoppiano sempre in maniera complementare (adenina con timina e guanina con citosina).

Ciascun gene è composto da una specifica sequenza di basi azotate e può essere lungo da poche centinaia a circa 2 milioni di basi. Le informazioni contenute all'interno dei geni vengono trasmesse tramite la creazione di una copia di RNA (acido ribonucleico) che, come una fotocopia di un libro presente in una biblioteca, permette la trasmissione dell’informazione contenuta senza il rischio di perdere o danneggiare la fonte originale. La copia del DNA, l'RNA, viene generata grazie alla complementarietà delle basi azotate. L’RNA è una struttura molto simile al DNA; esso però è costituito da un solo filamento e dall’alternarsi dei nucleotidi composti da uno zucchero pentoso (il ribosio, la “R” dell’acronimo RNA), un gruppo fosfato e una delle quattro basi azotate adenina e guanina, le purine, e citosina e uracile (U), le pirimidine. Ciascun filamento di RNA contenente le informazioni genetiche presenti nel DNA, viene poi letto e codificato, per la produzione di proteine. Il noto “codice genetico” non è altro che un codice di triplette di nucleotidi, ciascuna codificante per uno specifico aminoacido. Il susseguirsi di triplette quindi viene letto e codificato nella corrispettiva sequenza di amminoacidi; questi vanno poi a costituire la proteina.

Esiste anche una piccola parte di DNA che non è contenuta nel nucleo ma nei mitocondri (una specie di centrali energetiche) delle cellule. I mitocondri sono localizzati nel citoplasma delle cellule e sono molto importanti per il mantenimento della funzionalità cellulare; al loro interno è presente il DNA “mitocondriale” il quale codifica per molte delle proteine mitocondriali presenti.

Il processo che permette la codifica delle informazioni dal DNA fino alla produzione delle proteine è chiamato espressione genica. Non tutti i geni sono espressi contemporaneamente o nella stessa area dell'organismo. L'espressione genica, peculiare per ciascuna area dell'organismo, è controllata da una complessa rete di regolazione che consente lo sviluppo di differenti tipi cellulari per differenti tessuti (esempio cellule muscolari, cellule nervose ecc...) e anche l'adattamento immediato alle variazioni ambientali.

Il “genotipo” di una persona rappresenta la sua identità genetica ed è costituito dalla sequenza del DNA e dalla combinazione dei geni presenti. L’espressione fisica del genotipo viene detta invece “fenotipo”, che corrisponde alle caratteristiche osservabili, come il colore degli occhi o dei capelli.

Le differenze di fenotipo in persone diverse derivano dalle variazioni del genotipo. Sebbene il genotipo sia piuttosto simile in tutti gli esseri umani, la presenza di piccole variazioni è in grado di determinare grandi differenze fenotipiche che rendono ciascun individuo unico. Anche le condizioni ambientali, come l'alimentazione, l'esposizione ai raggi solari, le tossine, le infezioni o i traumi, possono influenzare il fenotipo.

Le "variazioni" o "varianti" del genotipo possono avere effetti diversi. Molte di queste non hanno effetti sullo stato di salute degli individui nonostante talvolta siano responsabili della comparsa di alcune patologie.

• Alcune varianti genetiche, seppur presenti, non comportano alcuna variazione apprezzabile nell'organismo. Vengono dette "benigne" e non causano malattia.
• Alcune variazioni sono molto comuni nella popolazione generale (si manifestano in più dell'1% della popolazione generale) e sono pertanto considerate "normali". Queste variazioni sono chiamate polimorfismi. I polimorfismi genetici, sia sul DNA mitocondriale che su quello nucleare, aiutano l’identificazione degli individui. Sono conseguenza del processo di evoluzione e di selezione naturale e sono legati alla biodiversità, all’adattamento ed alla variabilità genetica.
• Alcune varianti determinano la produzione di proteine alterate o non funzionali. Si tratta in genere di varianti patogeniche (che causano malattia) e sono dette mutazioni. Talvolta le mutazioni comportano la produzione di proteine dotate di funzionalità alterate che interferiscono con la loro normale attività: queste potrebbero non essere regolate in maniera corretta, non attivandosi o disattivandosi al momento opportuno, o potrebbero non trovarsi nel tessuto corretto.
• Esistono moltissime variazioni del genoma per le quali gli scienziati e i clinici non sono ancora riusciti a definire l'impatto sullo stato di salute delle persone. L'identificazione di queste varianti viene di solito indicata con varianti di incerto significato. Ogni giorno gli scienziati cercano di acquisire nuove informazioni circa il ruolo di queste varianti, molte delle quali potrebbero non avere correlazione con le malattie.

Nella tabella sottostante sono riportate alcuni esempi di mutazioni responsabili di malattie genetiche.

Le mutazioni ereditarie, dette talvolta anche "costituzionali"  o "germinali", sono alterazioni del DNA che sono presenti fin dalla nascita in tutte le cellule dell'organismo. Alcune varianti sono dette germinali anche per sottolineare la loro capacità di essere trasmesse alla prole (le nostre cellule germinali sono le cellule dalle quali originano gli ovuli e gli spermatozoi e che, come le altre cellule dell'organismo, contengono le mutazioni)

Le mutazioni somatiche sono alterazioni del DNA che compaiono dopo la nascita. Queste possono interessare una o più cellule nel corso della vita e pertanto non sono presenti in tutte le cellule dell'organismo. La maggior parte di queste mutazioni possono non alterare la salute della persona. Tuttavia, l'accumulo di alcune mutazioni somatiche può, nel tempo, aumentare il rischio di sviluppare il cancro o altre patologie. Alcune mutazioni somatiche vengono causate dall'esposizione a specifici fattori ambientali, come i raggi ultravioletti nei tumori della pelle. Altre volte, la causa delle mutazioni somatiche non è nota. Un esempio di mutazioni somatiche patologiche sono le mutazioni JAK2, associate a policitemia vera, trombocitemia essenziale e mielofibrosi primaria.

Esistono molteplici combinazioni con le quali un polimorfismo o una mutazione possono essere ereditati.

L’ereditarietà può essere dominante o recessiva. Come detto in precedenza, in ciascun individuo sono presenti due copie dello stesso cromosoma (cromosomi omologhi), uno di origine materno e uno di origine paterno. Quando la trasmissione di una singola copia di un gene, presente quindi su uno solo dei cromosomi omologhi, è sufficiente per lo sviluppo del fenotipo corrispondente (sia esso il colore degli occhi o una malattia), allora si parla di carattere dominante. Se invece per la manifestazione fenotipica è necessario ereditare entrambi i cromosomi contenenti quella caratteristica, allora si parla di carattere recessivo.

Nell’ambito delle 22 coppie di autosomi si parla quindi di trasmissione:

• Autosomica dominante - gli autosomi (cromosomi non sessuali) sono 22 coppie. Perché una patologia o un carattere autosomico dominante si manifesti, è sufficiente che venga ereditata una cola copia del gene contenente la variante/mutazione (presente sul cromosoma di origine materno o su quello di origine paterno). Le persone con una variante o una mutazione autosomica dominante hanno il 50% di possibilità di passarla alla progenie. Esempi di malattie autosomico dominanti sono l'ipercolesterolemia familiare, la neurofibromatosi di tipo 1 e la sindrome di Marfan. La fossetta sul mento è un esempio di carattere autosomico dominante.
• Codominanza - raramente due o più alleli possono essere codominanti; questo significa che i caratteri associati alle varianti genetiche presenti su entrambi i geni omologhi sono espressi insieme. Un esempio è il gruppo sanguigno AB, nel quale sono espresse sulla superficie dei globuli rossi sia le proteine antigeniche A che B.
• Autosomica recessiva - una variante/mutazione autosomica recessiva per manifestarsi ha bisogno di essere presente su entrambi i cromosomi omologhi, sia quello di origine materna che paterna. Nelle patologie autosomiche recessive, la presenza di un gene normale con la presenza di un solo gene alterato, è sufficiente a non consentire la manifestazione della patologia. Le persone che presentano una sola copia del gene alterato vengono dette portatori. Il portatore, sebbene non affetto, può trasmettere il gene alterato alla prole. Le patologie autosomico recessive si manifestano quando entrambi i genitori presentano almeno una copia del gene alterato e le trasmettono entrambi al figlio affetto. Esempi di patologie ereditarie autosomico recessive sono la fibrosi cistica, l'anemia falciforme e l'emocromatosi.
• Sex-linked - La trasmissione dei geni presenti sui cromosomi sessuali ha caratteristiche peculiari. I geni possono essere presenti sul cromosoma X (X-linked) o Y (Y-linked).
  • In caso di malattie X-linked recessive, la femmina può essere portatrice del gene anomalo in uno dei due cromosomi X presenti, ed essere quindi portatrice non affetta, o può avere entrambi i geni mutati, e quindi sviluppare la malattia. Nei maschi invece non è presente la seconda copia del gene X, ma il gene Y. Per questo motivo tutti i maschi con il gene recessivo sul cromosoma X, sviluppano la malattia. Alcuni esempi includono l’emofilia o la distrofia muscolare di Duchenne.
  • Le malattie X-linked dominanti sono relativamente rare. Queste malattie sono dovute alla presenza di un gene mutato in una sola copia del gene presente sul cromosoma X, indipendentemente dal sesso. Tuttavia, poiché ciascuna cellula di un individuo di sesso femminile inattiva casualmente uno dei due cromosomi X, le femmine possono avere sintomi più lievi rispetto ai maschi. Tra le malattie X-linked dominanti vi sono la sindrome di Rett e alcune forme di rachitismo ipofosfatemico ereditario.
  • Nelle malattie Y-linked il gene mutato è presente sul cromosoma Y. Queste malattie possono essere trasmesse esclusivamente di padre in figlio e sono molto rare. Un esempio è la perdita d'udito ereditaria.
• DNA mitocondriale ed ereditarietà materna - i mitocondri, degli organelli posti nel citoplasma delle cellule, presentano al loro interno alcuni frammenti di DNA. L'ereditarietà mitocondriale e quasi esclusivamente di origine materna,e derivano dall'ovulo. Sebbene le malattie associate al DNA mitocondriale possano colpire sia i maschi che le femmine, questi geni vendono trasmessi solo dalla madre ai figli e non hanno trasmissione paterna.
   

I meccanismi alla base dell’ereditarietà sono spesso complessi ed influenzati da molteplici fattori in grado di influenzare il modo con il quale i caratteri vengono trasmessi.

I test diagnostici genetici vengono utilizzati per la diagnosi o esclusione di patologie genetiche in individui sintomatici. Esistono centinaia di test per la diagnosi di molte patologie ereditarie. Molti di questi ricercano alterazioni in geni specifici responsabili di patologie come la fibrosi cistica, l'anemia falciforme o alcune forme particolari di distrofia muscolare.

Molte patologie ereditarie possono essere identificate indirettamente tramite la rilevazione di anomalie nei prodotti finali (proteine o metaboliti) di geni che potrebbero essere alterati. Il codice genetico contiene le informazioni per la produzione di molteplici proteine cosicché una sua variazione determina l'alterazione della produzione delle proteine corrispondenti. Un esempio è l'emofilia, una sindrome emorragica. Lo screening rileva la diminuzione di alcuni fattori della coagulazione (proteine che regolano la coagulazione) in grado di suggerire la presenza di una sindrome emorragica. I test genetici forniscono indicazioni utili per la ricerca della stessa mutazione nei familiari dell'individuo affetto.

I test presintomatici consentono di predire la comparsa di patologie genetiche non ancora manifestatesi. Questi test sono di solito usati per la diagnosi di patologie ad esordio tardivo, come la malattia di Huntington e l'emocromatosi ereditaria, in persone con anamnesi familiare positiva per la presenza di queste patologie.

I test predittivi consentono di predire il rischio individuale di sviluppare una certa patologia al fine di intraprendere azioni preventive volte a diminuire il rischio di comparsa. Per esempio, le donne con una storia familiare positiva per il cancro della mammella possono sottoporsi al test per la ricerca delle mutazioni di BRCA1 e BRCA2, associate al rischio aumentato di svilupp

I test per la verifica dello stato di portatore consentono di rilevare la presenza di una variante genetica che potrebbe essere trasmessa alla prole e causare anche una patologia nel caso in cui questa, o una simile, sia presente anche nel partner. Questo tipo di test può essere offerto alle coppie che progettano una gravidanza e che sono a rischio per la storia familiare di patologie autosomico recessive.

Un portatore di una variante autosomico recessiva di solito è asintomatico o presenta soli lievi sintomi. Ma nel caso in cui i suoi figli ereditino due copie del gene mutato, una da ciascun genitore, allora è possibile che la malattia di manifesti. Per ciascuna gravidanza, i genitori entrambi portatori di una variante autosomico recessiva hanno il 25% di possibilità di avere un figlio affetto, il 50% di possibilità di avere un figlio portatore asintomatico e il 25% di possibilità di avere un figlio sano e non portatore. I test eseguiti comunemente includono quelli per la malattia di Toy-Sachs, la fibrosi cistica e l'anemia falciforme.

Questi test possono essere eseguiti anche per verificare lo stato di portatore di una patologia X-linked recessiva nella madre.

I test genetici prenatali forniscono informazioni circa la possibilità di un feto di essere affetto da patologie genetiche. Spesso questi test ricercano la presenza di aneuploidie, ossia la presenza di cromosomi sovra- o sotto-numerari.

I test di screening prenatali eseguiti su sangue materno, vengono di solito offerti durante il primo e il secondo trimestre di gravidanza (vedi screening del primo trimestre di gravidanza e screening del secondo trimestre di gravidanza). Oltre a questi, possono essere offerti anche i test non invasivi eseguiti su DNA fetale libero circolante. Questi ultimi ricercano il materiale genetico rilasciato dalla placenta e presente nel circolo materno, consentendo l'esecuzione di uno screening non invasivo per la sindrome di Down, di Edwards e di Patau, a partire dalla decima settimana di gestazione.

Non si tratta di test diagnostici e richiedono ulteriori approfondimenti. Un risultato positivo ai test di screening deve comunque essere confermato tramite l'analisi diretta del materiale di origine fetale raccolto tramite l'amniocentesi o la villocentesi. Questi test sono accompagnati da un rischio, seppur minimo, di aborto.

In Italia lo screening neonatale è in vigore dal 1992, quando la  legge quadro 5 febbraio 1992, n. 104 ha introdotto l'obbligo dell'esecuzione gratuita dello screening su tutti i nuovi nati tra la 48° e la 72° ora di vita, per l'ipotiroidismo congenito, la fibrosi cistica e la fenilchetonuria. Con la  Legge 19 agosto 2016, n. 167 e il DM 13 ottobre 2016 è stato poi introdotto lo screening neonatale esteso (SNE), che prevede l'esecuzione dei test per circa 40 malattie metaboliche congenite, per ciascuna delle quali è disponibile un trattamento terapeutico in grado di migliorare l'aspettativa e la qualità della vita degli affetti. Questi test vengono eseguiti gratuitamente su un prelievo di sangue eseguito pungendo il tallone del neonato.

La farmacogenomica (e la farmacogenetica) è la branca della biologia che studia i meccanismi alla base della variabilità individuale nella risposta ai farmaci. È infatti noto a chiunque il fatto che lo stesso farmaco può essere in grado di sviluppare effetti collaterali in una persona ma non in un’altra. Tutto questo dipende dall’assetto genetico individuale e quindi dai geni ereditati.

I test genetici di farmacogenomica rilevano la presenza di varianti in geni codificanti per enzimi dotati di un ruolo centrale nella risposta farmacologica. Nell'organismo esistono moltissimi enzimi deputati al metabolismo dei farmaci, consentendone l'eliminazione tramite l'urina o altre vie. In alcuni casi, la diminuzione dell'attività di questi enzimi comporta l'accumulo del farmaco all'interno dell'organismo; in altri casi gli enzimi eliminano lo stesso troppo in fretta, prima che questo abbia esplicato la sua azione.

Alcune varianti genetiche non sono ereditarie, ma compaiono nelle cellule dopo la nascita e non possono essere trasmesse alla prole. Si tratta delle mutazioni somatiche che possono essere presenti in varie forme di cancro. Le mutazioni somatiche possono essere causate da fattori ambientali, come l'esposizione ai raggi ultravioletti o il fumo, ma spesso sono ad eziologia ignota.

I test genetici consentono di rilevare le mutazioni somatiche presenti nelle cellule tumorali e che possono fornire indicazioni prognostiche e utili per le scelte terapeutiche. Questi test vengono di solito eseguiti su campioni di tessuto tumorale, nonostante sia sempre più diffusa l'utilizzo della biopsia liquida, ossia l'esecuzione dei test su materiale genetico tumorale isolato a partire da campioni di sangue periferico.

Esistono delle terapie, note con il nome di "target therapy" o terapie mirate, in grado di attaccare i tumori in maniera mirata, limitando al massimo il danneggiamento delle cellule normali. Molte di queste terapie sono accompagnate da test specifici in grado di rilevare la presenza della mutazione verso la quale l'agente terapeutico è efficace. Inoltre esistono certi tipi di tumori caratterizzati dalla presenza di alcune mutazioni in grado di fornire indicazioni prognostiche circa l'efficacia o meno di approcci terapeutici e/o chemioterapici. Alcuni tipi di tumore per i quali sono disponibili test genetici per la terapia mirata sono in cancro della mammella, la leucemia mieloide cronica, il cancro al polmone e il melanoma. Per maggiori dettagli si rimanda all'articolo "Test genetici per la terapia mirata dei tumori".

I test genetici consentono di verificare la compatibilità tra donatore e ricevente in caso di trapianto d'organo o tessuti, come reni, polmoni o midollo osseo. La mancata compatibilità infatti potrebbe comportare la comparsa di gravi reazioni di rigetto nei confronti dell'organo/tessuto trapiantato.

I test di laboratorio di base per la determinazione della compatibilità tra donatore e ricevente consistono nel mettere a contatto i leucociti del donatore con quelli del ricevente ed osservare la presenza dell'eventuale attivazione della risposta immunitaria. La proliferazione di una specifica popolazione di leucociti è indice di una risposta immunitaria in atto e può prevedere il possibile rigetto del trapianto. Sebbene questo metodo sia ancora utilizzato, le moderne tecniche di diagnostica genetica consentono di tipizzare genotipicamente sia il donatore che il ricevente al fine di diminuire il rischio di rigetto in caso di trapianto.

Per la tipizzazione tissutale viene analizzata una serie specifica di geni, presente sul cromosoma 6 e nota con il nome “Complesso Maggiore di Istocompatibilità” (MHC). Questi geni sono molto differenti tra individui diversi (polimorfici) e codificano per glicoproteine antigeniche espresse sulla superficie delle cellule e responsabili del riconoscimento di organi e tessuti come appartenenti all’organismo (self). Questi antigeni sono in grado di indurre una risposta immunitaria e quindi il rigetto in caso vengano riconosciuti come estranei dal sistema immunitario dell’organismo ricevente. Per maggiori dettagli si rimanda alla pagina "Tipizzazione HLA".

Questo tipo di test viene perlopiù utilizzato nell’ambito della medicina forense. Il termine “test del DNA” è un termine improprio che in realtà è riferibile a qualsiasi test genetico, sia esso utilizzato per la diagnosi delle patologie, per la tipizzazione dei tessuti o per l’identificazione di persone.

Per lo scopo forense, il DNA, sia esso nucleare o mitocondriale, viene estratto a partire da molteplici campioni: sangue, capelli, tessuti, ossa ecc…. Qualsiasi materiale contenente cellule nucleate e quindi contenenti il DNA, può essere utilizzato per le analisi forensi. Il DNA mitocondriale è particolarmente utile nel caso di campioni degradati.

I test di identificazione vengono utilizzati per cercare di identificare le persone sospettate di un crimine o anche per identificare ed attribuire i resti di persone irriconoscibili a causa della decomposizione. Per questo tipo di confronti vengono analizzate le ripetizioni di sequenze di DNA chiamate microsatelliti o minisatelliti, uniche per ciascun individuo. Nella biologia forense queste metodiche vengono indicate con il termine “DNA fingerprint”, che fa riferimento ad una sorta di impronta digitale del DNA, specifica per ciascun individuo.

L'obiettivo primario del test di paternità è quello di identificare il genitore biologico di una persona. Viene fatto per identificare il genitore o i genitori di un individuo in, ad esempio, casi di presunta paternità o adozione. Questa valutazione richiede molta attenzione e deve permettere l’identificazione del genitore presunto, con almeno 99% di probabilità. Per questo scopo possono essere utilizzate molte procedure di laboratorio, simili a quelle utilizzate a scopo forense, inclusa l’estrazione e la manipolazione del materiale genetico volta ad assicurare la sua unicità.

Il risultato del test viene fornito in termini probabilistici, ossia come la probabilità che un certo soggetto sia il genitore biologico di un altro.

La PCR (Reazione a Catena della Polimerasi; Polymerase Chain Reaction; PCR) è una tecnica di laboratorio utilizzata molto frequentemente che consente di ottenere un numero enorme di copie di piccoli frammenti di DNA a partire da campioni contenenti quantità minime di DNA originario. Questo processo, noto come "amplificazione", consente la rilevazione e la misura dei geni d'interesse, oltre che la creazione di molteplici copie di DNA, utilizzabili per essere sequenziate o analizzate con altre tecniche. Spesso viene usata per la ricerca delle mutazioni genetiche responsabili di alcune patologie, come quelle associate con alcuni tipi di cancro o di malattie genetiche.

Per maggiori dettagli si rimanda alla pagina Tecniche di Laboratorio.

Il sequenziamento consente di definire l'ordine delle basi [adenina (A), timina (T), citosina (C) e guanina (G)] che compongono il DNA, fornendo informazioni su eventuali mutazioni presenti nei geni o nelle regioni regolatorie, che potrebbero essere correlati ad alcune malattie.

Sequenziamento di un singolo gene (sequenziamento Sanger)

Per molti anni, il sequenziamento con il metodo Sanger è stato il metodo di riferimento per l'analisi di un singolo gene o di pochi geni contemporaneamente. Questo metodo si basa sull'utilizzo di nucleotidi marcati con coloranti specifici, diversi per le quattro basi del DNA (A, T, C e G). Questa è la stessa tecnica usata per il sequenziamento del genoma umano nel "Progetto genoma" ma consente il sequenziamento di brevi frammenti per ciascuna seduta.

Next Generation Sequencing (NGS): sequenziamento dell'intero genoma

Il sequenziamento del genoma umano del "Progetto genoma" conclusosi nel 2003, ha richiesto oltre un decennio per la sua realizzazione con il metodo Sanger. Le tecnologie odierne consentono di fare la stessa cosa in pochi giorni. Queste tecnologie vengono dette "tecnologie NGS" e la loro velocità dipende dal fatto che consentono il sequenziamento di milioni di frammenti di DNA contemporaneamente. Le tecniche NGS consentono di analizzare velocemente tutti i circa 22.000 geni responsabili della produzione delle proteine. I geni sono le porzioni del DNA contenenti le informazioni necessarie alla codifica delle proteine. Il DNA è costituito da porzioni codificanti e porzioni non codificanti che, insieme, costituiscono il genoma.

Le tecnologie NGS sono attualmente sempre più diffuse e vengono usate sia a scopo clinico che non. Per esempio possono essere usate per la valutazione della predisposizione al cancro della mammella o dell'ovaio. A questo scopo possono essere analizzati allo stesso tempo molti geni in modo da valutare il rischio complessivo sulla base delle varianti eventualmente presenti. Tuttavia, al momento dell'identificazione di una specifica variante all'interno di una famiglia, è spesso sufficiente ricercare negli altri familiari quella variante e non eseguire il sequenziamento dell'intero genoma.

I risultati dell'NGS devono essere interpretati con molta attenzione e competenza. L'NGS è in grado di identificare moltissime varianti, per molte delle quali però il significato non è noto. Molto spesso alle mutazioni identificate non vengono associate patologie specifiche. Per quanto motivo, prima di sottoporsi al test e per l'interpretazione dei risultati, è necessario rivolgersi ad un consulente genetico che possa spiegare il risultato e le sue implicazioni.

Ciascuna persona possiede 23 coppie di cromosomi, 22 di autosomi e una di cromosomi sessuali. La scienza che studia i cromosomi si chiama “citogenetica” e i professionisti deputati all’analisi di questi cromosomi sono chiamati citogenetisti. Il citogenetista analizza il numero, la forma e il pattern di colorazione dei cromosomi in modo da rilevare alterazioni del numero dei cromosomi o della loro forma (riarrangiamenti, delezioni, duplicazioni ecc…).

Analisi dei cromosomi (cariotipo)

Lo studio dei cromosomi prevede l’estrazione di questi dal nucleo delle cellule, il loro posizionamento su specifici vetrini utilizzati per la colorazione e quindi per l’analisi microscopica. Talvolta l’analisi prevede l’acquisizione di una foto a partire dalla quale l’immagine dei cromosomi può essere "tagliata" e posizionata in modo da evidenziare tutte le coppie di cromosomi presenti, ordinati secondo la numerazione crescente (da 1 a 22, X e Y) basata sulle dimensioni e la colorazione.

Esistono molte patologie associate all’alterazione del numero di cromosomi. La Sindrome di Down ad esempio, è caratterizzata dalla presenza di un cromosoma 21 sovrannumerario ed è pertanto chiamata trisomia21 (tre cromosomi numero 21). La perdita di un cromosoma è responsabile, ad esempio, della sindrome di Turner nella quale le femmine presentano un solo cromosoma X. In questo caso, la presenza di un solo cromosoma della coppia è nota con il nome di “monosomia”.

Talvolta dei pezzi di cromosoma possono rompersi ed attaccarsi ad un altro cromosoma in maniera impropria; in questo caso si parla di “traslocazione” o "riarrangiamento". Un esempio di patologia causata da una traslocazione è la leucemia mieloide cronica (CML) nella quale una parte del cromosoma 9 si rompe attaccandosi al cromosoma 22 creando il gene di fusione BCR-ABL1, o il linfoma di Burkitt nel quale un pezzo del cromosoma 8 trasloca sul cromosoma 14. Questo tipo di alterazioni spesso determina la comparsa di tumori. Durante il processo di traslocazione è infatti possibile che geni implicati nella genesi tumorale vengano spostati in aree del genoma caratterizzate da sistemi di regolazione dell'espressione genica diversa dall'originale con la conseguente totale alterazione del controllo della loro espressione. Talvolta le traslocazioni possono essere rilevate tramite l’analisi microscopica poiché evidenziate da alterazioni nella colorazione dei cromosomi.

Ibridazione Fluorescente in Situ (FISH)

Spesso le alterazioni dei geni presenti nei cromosomi vengono messe in evidenza tramite una tecnica particolare chiamata FISH o ibridazione fluorescente in situ. Questa tecnica permette di evidenziare, tramite sonde fluorescenti, le alterazioni genetiche presenti. Usando più sonde contemporaneamente, i citogenetisti possono confrontare e valutare la localizzazione delle stesse (e quindi dei frammenti cromosomici ai quali si legano) per verificare se esse siano nella loro posizione normale, siano traslocate in aree differenti o se siano presenti in più copie.

Molte alterazioni genetiche associate al cancro vengono rilevate in questo modo. Ad esempio, questo è uno dei metodi utilizzati per la rilevazione dell’amplificazione del gene ERBB2 (chiamato anche HER2) nel carcinoma mammario. Esistono molteplici applicazioni della FISH, come la rilevazione delle microdelezioni cromosomiche: in questo la perdita totale di intere porzioni di cromosoma rende impossibile il legame della sonda fluorescente in qualsiasi area.

Il microarray è una tecnologia che può essere utilizzata per molteplici scopi. In diagnostica, consente di rilevare la presenza di duplicazioni, delezioni o alterazioni di frammenti di DNA che potrebbero essere associati a malattie. Come il cariotipo o la FISH, consente di analizzare tutti i cromosomi contemporaneamente ma rilevando alterazioni più piccole. Tramite i microarray è possibile rilevare anche alterazioni piccolissime note con il nome di SNPs (single nucleotide polymorphismsms) ossia polimorfismi di un singolo nucleotide. 

I microarray sono costituiti da migliaia di piccoli frammenti di DNA a singolo filamento attaccati ad una superficie solida, come un chip. Le sequenze di DNA presenti comprendono sia frammenti "normali" che differenti versioni del gene in esame, con le possibili mutazioni di interesse clinico. Il campione di DNA dell'individuo sottoposto al test viene processato e colorato con un colorante fluorescente; quindi viene aggiunto al microarray. Le sequenze di DNA presenti nel campione in esame si appaiano con le sequenze complementari presenti sul microarray. Il pattern di fluorescenza risultante viene analizzato ed interpretato alla ricerca delle alterazioni.

I profili di espressione genica consentono di rilevare quali geni siano attivi e quali no all'interno delle cellule. Per espressione genica si intende il processo attraverso il quale viene regolata la produzione delle proteine codificate dai geni. Tessuti differenti esprimono diversi gruppi di geni sulla base del ruolo che devono svolgere all'interno dell'organismo. Le informazioni contenute nei geni vengono utilizzate per la costruzione dell'RNA il quale, a sua volta, trasmette le informazioni per la produzione delle proteine. L'espressione genica viene studiata analizzando l'RNA presente nei campioni di tessuto in esame così da rilevare quali siano i geni attivi (trascritti in RNA) e quali quelli inattivi.

Un esempio è il test per i profili di espressione genica per in cancro della mammella. Questi test valutano la produzione di RNA da parte di uno specifico gruppo di geni in campioni di tessuto tumorale al fine di reperire informazioni circa la prognosi, le eventuali ricadute e la diffusione (metastasi) del cancro, oltre che per avere informazioni utili ai fini terapeutici

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