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Tecniche di Laboratorio

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Ultima Revisione: 21.05.2018. Ultima Modifica: 02.11.2018.

I laboratori utilizzano moltissime tecniche differenti per testare innumerevoli analiti di interesse medico. La conoscenza dei metodi utilizzati all'interno dei laboratori fornisce alcuni elementi per una migliore comprensione dei risultati di laboratorio. Nel presente articolo vengono presentate alcune tra le più comuni tecniche utilizzate.

Le tecniche di laboratorio di basano su principi scientifici consolidati di biologia, chimica e fisica, e comprendono tutti gli aspetti del laboratorio clinico, dalla quantificazione del colesterolo nel sangue, all'analisi del DNA alla crescita di organismi responsabili di infezioni. Spesso sono molto simili alle ricette di un libro di cucina, con procedure o processi utilizzati per testare i campioni biologici per particolari analiti o sostanze. Il laboratorista segue le procedure passo passo fino a quando il prodotto finale, il risultato di un test, viene raggiunto.

Alcuni metodi, come alcune ricette, sono molto più complicati e laboriosi di altri e richiedono diversi gradi di esperienza. Spesso esistono più metodi che possono essere utilizzati per testare la stessa sostanza. Di conseguenza, lo stesso analita può essere testato in modo diverso in diversi laboratori, fatto cruciale nel confronto dei risultati dei test.

La descrizione dei metodi seguenti si prefigge di fornire alcune nozioni riguardo i principi utilizzati e le fasi necessarie per l'ottenimento di un risultato. Questo per fornire al lettore alcuni strumenti utili per la comprensione dei test ai quali si sottopone. Il presente articolo non ha la pretesa di essere esaustivo, e non include tutte le possibili tecnologie presenti.

Immunometria

Principi Generali

 

Le immunoglobuline sono proteine prodotte dal sistema immunitario in grado di riconoscere, legare e neutralizzare elementi estranei nell'organismo. I test immunometrici si basano sul legame altamente specifico tra le immunoglobuline (chiamate anticorpi) e la sostanza da essi riconosciuta (la molecola estranea definita antigene). I test immunometrici consentono di rilevare specifici antigeni o anticorpi nel sangue ed in altri fluidi corporei.

Nel caso in cui i test immunometrici si prefiggano di ricercare la presenza di specifici anticorpi nel sangue o in altri fluidi corporei, gli antigeni fanno parte del sistema di rilevazione. Gli anticorpi presenti nel campione in esame, reagiscono e legano gli antigeni del sistema di rilevazione, e il test fornisce un risultato positivo. Se questo riconoscimento antigene-anticorpo non avviene, il risultato del test è negativo. Esempi di test immunometrici per la ricerca di specifici anticorpi sono il Fattore Reumatoide (FR) (che ricerca gli autoanticorpi presenti nell'artrite reumatoide), il test per il virus di West Nile (che ricerca gli anticorpi prodotti dal sistema immunitario in risposta all'infezione del virus) o il test per l'epatite B (che ricerca gli anticorpi prodotti in risposta alla vaccinazione).

Nel caso in cui i test immunometrici vengano utilizzati per la ricerca di specifici antigeni nel sangue o in altri fluidi corporei, sono invece gli anticorpi a far parte del sistema di rilevazione. La reazione tra l'anticorpo del sistema di rilevazione e l'antigene presente nel campione viene confrontata con le reazioni che avvengono a concentrazioni note di antigene, in modo da risalire alla quantità di antigene presente nel campione. Esempi di test immunometrici per la rilevazione di antigeni sono il test per la digossina o la vancomicina, i test per la misura di alcuni ormoni (come insulina, TSH, estrogeni) o i marcatori tumorali (come PSA, CA-125, AFP).

Fonti

(© 2006). Immunoassay Detection Technologies, Chapter 2. Abbott Diagnostics Scientific Resources Learning Guide [On-line information]. PDF available for download through http://www.abbottdiagnostics.com

Clarke, W. and Dufour, D. R., Editors (2006). Contemporary Practice in Clinical Chemistry, AACC Press, Washington, DC. Harris, N. and Winter, W. Chapter 10, Immunoassays. Pp. 117-119.

Biologia molecolare

Ibridazione Fluorescente in Situ (Fluorescence in situ hybridization; FISH)

Questo test molecolare utilizza delle sonde fluorescenti per valutare i geni e/o il DNA nei cromosomi.

Gli esseri umani normalmente possiedono 23 coppie di cromosomi: 22 coppie non determinanti il sesso (autosomi) e 1 coppia di cromosomi sessuali (eterocromosomi), XX per le femmine e XY per i maschi. I cromosomi sono costituiti perlopiù da DNA altamente compattato, ossia da una sequenza di quattro basi che, combinandosi i vari modi, forma i migliaia di geni responsabili della produzione di tutte le proteine del nostro organismo. Il DNA è costituito da due filamenti complementari avvolti insieme a formare una doppia elica destrorsa.

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Struttura del DNA. (a) Il DNA è costituito da un doppio filamento avvolto a formare una doppia elica destrorsa. (b) I due filamenti sono antiparalleli e complementari. (c) Ciascun filamento è costituito da unità di zucchero-fosfato legate ciascuna ad una delle 4 diverse basi (adenina, guanina, citosina, timina). L'adenina è complementare alla timina e la guanina alla citosina.

Fonte immagine: OpenStax Microbiology. ​​​
Fornito da: OpenStax CNX Licenza: CC BY: Attribution
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Per l'esecuzione della FISH, un campione delle cellule del paziente, contenenti il DNA, viene posto su un vetrino. Il campione può essere sangue, midollo osseo, liquido amniotico o cellule tumorali, sulla base delle necessità diagnostiche. I vetrini vengono scaldati per separare le doppie eliche del DNA (denaturazione). Quindi vene aggiunta una sonda marcata con un fluorocromo (sonda fluorescente). La sonda è un singolo filamento complementare ad una specifica regione di interesse nel DNA del paziente. Dopo la denaturazione del DNA, la sonda può legarsi alla regione di interesse, se presente. L'analisi del campione con uno speciale microscopio (microscopio a fluorescenza) consente di rilevare la sonda fluorescente come un puntino luminoso su uno sfondo scuro.

Questa tecnica consente di rilevare cromosomi sovrannumerari o mancanti, delezioni (sequenze geniche perse) o traslocazioni (sequenze geniche spostate in altri cromosomi). La FISH consente quindi di diagnosticare alcune patologie caratterizzate dalla presenza di cromosomi sovrannumerari (come la sindrome di Down o trisomia 21). Sulla base delle esigenze diagnostiche possono essere utilizzate una o più sonde differenti. Ad esempio, per analizzare più aree del DNA contemporaneamente, possono essere utilizzate sonde marcate con fluorocromi differenti e quindi facilmente distinguibili al microscopio.

I paragrafi seguenti descrivono alcuni esempi di applicazioni della tecnica FISH.

Sindrome di Down
La figura 1 mostra una FISH effettuata sulle cellule del liquido amniotico ottenute da una donna in gravidanza con un feto con sospetta sindrome di Down (trisomia 21). Il segnale verde (due copie) corrisponde al cromosoma 13, utilizzato come controllo del corretto funzionamento del test. Il segnale rosso corrisponde invece al cromosoma 21. Nell'immagine sono presenti tre segnali rossi, indicativi della presenza di tre cromosomi 21 e quindi della sindrome di Down. Per la corretta interpretazione del test è necessario rivolgersi al consulente genetico.

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Figura 1: Una cellule del liquido amniotico positiva per la trisomia 21.
Fonte immagine: Courtesy of Mary Lowery Nodberg, PhD

 

Cancro alla mammella
Nella figura 2, la FISH viene utilizzata per rilevare la presenza di un'amplificazione genica in una cellula tumorale. Il gene HER-2/neu corrisponde al segnale rosso. In circa il 25% dei casi di tumore alla mammella, sono presenti più copie di questo gene. Le donne con un'amplificazione di HER-2/neu possono essere trattate con il farmaco Herceptina, una terapia mirata verso la proteina codificata dal gene anomalo. Le donne negative per questa alterazione non devono essere trattate con questo farmaco poiché non possono riceverne i benefici.

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Figura 2: Cellule tumorali della mammella positive per l'amplificazione del gene HER-2/neu (segnale rosso). I segnali verdi corrispondono alle sonde di controllo utilizzati per verificare la corretta esecuzione del test. 

Fonte immagine: Courtesy of Mary Lowery Nodberg, PhD

 

Leucemia
La figura 3 mostra una FISH utilizzata per diagnosticare un tipo particolare di leucemia, la leucemia mieloide cronica. La sonda rileva la sequenza genica anomala BCR-ABL 1 originata dalla traslocazione di parte del cromosoma 22 (BCR, colore verde) e del cromosoma 9 (ABL1, colore rosso). Le aree gialle corrispondono alle zone nelle quali è presente il gene di fusione (il colore rosso e verde si sovrappongono generando il colore giallo). Il rilevamento della presenza del gene BCR-ABL 1 conferma la diagnosi di leucemia mieloide cronica; questi pazienti possono trarre beneficio dall'utilizzo del farmaco imatinib.

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Figura 3: Una cellula positiva alla FISH per la traslocazione BCR-ABL 1 (segnale giallo). Il colore giallo indica la presenza del gene di fusione sul quale si legano la sonda verde, corrispondente al gene BCR, e la sonda rossa, corrispondente al gene ABL1.

Fonte immagine: Courtesy of Mary Lowery Nodberg, PhD

 

Fonti

(August 16, 2010) Fluorescence In Situ Hybridization (FISH). National Human Genome Research Institute [On-line information]. Available online at http://www.genome.gov/10000206 through http://www.genome.gov. Accessed March 2011.

(August 16, 2010) Frequently Asked Questions about Genetic Testing. National Human Genome Research Institute [On-line information].Available online at http://www.genome.gov/19516567 through http://www.genome.gov. Accessed March 2011.

(March 6, 2006) Genetics Home Reference. Fluorescent in situ hybridization. Available online at http://ghr.nlm.nih.gov/glossary=fluorescentinsituhybridization through http://ghr.nlm.nih.gov. Accessed March 2011.

(June 29, 2011) Hiller B, Bradtke J, Balz H and Rieder H (2004). CyDAS Online Analysis Site. Available online at http://www.cydas.org/OnlineAnalysis/ through http://www.cydas.org. Accessed July 2011. 

Citofluorimetria

La citofluorimetria, o citometria, è una tecnologia di laboratorio che consente di rilevare, identificare e contare specifiche cellule presenti nel circolo ematico, nel midollo osseo, nei fluidi corporei come il liquido cefalorachidiano, o le cellule tumorali. Una delle applicazioni più note è la diagnosi di leucemia o linfoma. Per maggiori informazioni clicca QUI.

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