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Cos'è la citofluorimetria?

La citofluorimetria, o citometria, è una tecnologia di laboratorio che consente di rilevare, identificare e contare specifiche cellule. Questo metodo è anche in grado di identificare dei componenti particolari contenuti all'interno delle cellule. Queste informazioni possono essere raccolte grazie a dei protocolli di identificazione che prevedono la valutazione delle caratteristiche fisiche delle cellule ma anche della presenza o assenza di particolari marcatori, gli antigeni, presenti sulla superficie o all'interno delle cellule stesse. Questo metodo consente di studiare le cellule presenti nel circolo ematico, nel midollo osseo, nei fluidi corporei come il liquido cefalorachidiano, o le cellule tumorali.

Le tecniche citofluorimetriche prevedono diverse fasi:

  • Un campione di cellule viene sospeso in un fluido
  • Prima del test e sulla base delle cellule da analizzare, il campione viene trattato con coloranti specifici in grado di discriminare i sottotipi cellulari. Questo colorante (il fluorocromo) è attaccato a anticorpi monoclonali diretti verso particolari distretti cellulari o antigeni marcatori.
  • Il campione contenente le cellule marcate viene introdotto nello strumento chiamato citofluorimetro.
  • Nello strumento il fluido contenente le cellule viene incanalato nella camera di flusso e quindi attraverso un foro molto stretto, in modo tale da creare un flusso all'interno del quale le cellule risultano organizzate in fila, una dietro l'altra. Il flusso di cellule viene posto davanti ad un rilevatore, che così analizza ciascuna cellula presente all'interno del flusso ad una velocità altissima (da centinaia a migliaia di cellule per secondo).
  • Il citofluorimetro contiene uno o più laser e più rilevatori in grado di identificare alcune caratteristiche, uniche per ciascuna cellula. Ciascun laser colpisce le cellule presenti nel flusso, generando per ciascuna di esse uno scatter caratteristico e dipendente dalle caratteristiche della stessa. Le caratteristiche possono essere fisiche (dimensione e complessità cellulare) o possono dipendere dal segnale generato dal colorante (il fluorocromo) intercettato dal laser. La combinazione di queste informazioni genera un profilo caratteristico per ciascuna cellula presente all'interno del campione.
  • Il segnale rilevato dai rilevatori (o detector) viene amplificato (dai fotomoltiplicatori) e inviato al computer. Qui viene convertito in formato digitale e mostrato sul computer o stampato.
  • I dati sono, in genere, mostrati sotto forma di grafici.
citofluorimetro - schema

Questa analisi permette la valutazione delle caratteristiche e del numero delle cellule presenti nel campione. Il citofluorimetro è sufficientemente sensibile da analizzare cellule o particelle del diametro di un micron (circa 1/75 di un capello umano) e in un tempo relativamente breve, a partire da un campione piuttosto piccolo. In pochi minuti possono essere contate ed analizzate migliaia di cellule, fornendo un quadro accurato della composizione cellulare di qualsiasi tessuto o fluido corporeo.

scatter citofluorimetro
I dati acquisiti dal citofluorimetro vengono mostrati come grafici. Fonte immagine: Dr. Jeffery Jacobsen and Dominic Fasco

A partire da questa tecnologia è possibile anche separare fisicamente le cellule sulla base delle loro caratteristiche fisiche e di fluorescenza. Uno strumento, chiamato cell sorter, consente di effettuare questa operazione poiché dotato, dopo la camera di flusso, di una camera di separazione. Qui le cellule, caricate elettricamente (positive o negative) sulla base delle caratteristiche rilevate, vengono separate grazie a piatti di deflessione. Le cellule di interesse possono essere così separate sulla base delle loro caratteristiche.

Applicazioni

Il citofluorimetro è uno strumento disponibile ormai da tempo e con molteplici applicazioni. Di seguito vengono elencati solo alcuni esempi di test eseguiti tramite questa tecnologia:

La citofluorimetria consente anche di identificare cellule specifiche presenti solo in una certa patologia. Un esempio è l'uso del citofluorimetro nella diagnosi di leucemia o linfoma. Esistono moltissimi anticorpi monoclonali diversi, marcati con fluorocromi e in grado di riconoscere molteplici antigeni, come quelli espressi solamente in alcuni tipi di cellule tumorali. Queste informazioni sono utili per la diagnosi, la prognosi e il trattamento di molte patologie. L'utilità di queste informazioni è particolarmente accentuata in caso di diagnosi di tumori allo stadio precoce, nei quali la presenza di una sola cellula tumorale potrebbe passare inosservata con altri tipi di analisi (come quella microscopica).

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Fonti

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