Anatomia Patologica

Le biopsie ed i prelievi di tessuto rimossi dagli organi vengono di solito posti in formalina (formaldeide diluita) la quale è in grado di fissare i tessuti legando le proteine. Questo procedimento preserva la struttura cellulare e impedisce la degradazione dei tessuti. Esistono anche altri tipi di fissativi, utilizzabili per tessuti particolari o da utilizzare per il mantenimento di specifiche caratteristiche cellulari.

I tessuti da analizzare vengono trattati tramite una procedura a fasi che prevede la progressiva disidratazione e dissolvimento dei lipidi del tessuto da analizzare e quindi l’inclusione in paraffina a formare dei veri e propri blocchi. I campioni inclusi nei blocchi di paraffina sono così sufficientemente duri da essere tagliati in microscopiche fette dello spessore di circa 5 µm, tramite l’utilizzo di uno strumento chiamato microtomo (una sorta di affettatrice molto precisa). Le sottili fette di tessuto possono così essere poste su un vetrino e sottoposte ad ulteriori trattamenti con specifiche sostanze volte a colorare i tessuti ed esaltarne così le caratteristiche strutturali.

Il più noto colorante usato è l’Ematossilina-Eosina. Si tratta di una combinazione di un colorante basico (ematossilina) e uno acido (eosina). Questi coloranti reagiscono con gli elementi acidi e basici dei tessuti conferendo loro rispettivamente una colorazione violacea e rosastra.

La procedura di fissazione in formalina e d'inclusione in paraffina richiede un po’ di tempo. Perciò nel caso in cui il clinico abbia la necessità di conoscere in tempi bravi il risultato della biopsia, l’anatomo-patologo può decidere di non utilizzare questa procedura ma di procedere al congelamento del tessuto. A questo scopo il tessuto da analizzare viene posto in un fluido criopreservante chiamato polietilen-glicole e quindi posto in un blocco di metallo refrigerato chiamato criostato. Una volta congelato, il pezzo può quindi essere tagliato con un microtomo congelatore in sezioni sottili. La fettina di tessuto può quindi essere posta su un vetrino, colorata ed esaminata. Questa procedura richiede 15-20 minuti ma può anche creare degli artefatti, motivo per il quale richiede una più accurata conferma diagnostica.

Oltre all’ematossilina-eosina, gli anatomo-patologi utilizzano altri coloranti in grado di evidenziare strutture cellulari particolari come i grassi, i tessuti fibrosi, il muco, i microrganismi come funghi i batteri, le proteine ed altre sostanze chimiche utili nella diagnosi di particolari patologie.

Le colorazioni speciali, seppur molto specifiche, talvolta non consentono la formulazione di una diagnosi definitiva. Questa tecnica ha invece il vantaggio di utilizzare degli anticorpi in grado di riconoscere specifici elementi all’interno della cellula. Gli anticorpi, marcati con particolari coloranti, consentono quindi di evidenziare specifiche strutture rilevabili tramite l’analisi microscopica. La scelta degli appropriati anticorpi consente la formulazione della diagnosi da parte dell’anatomo-patologo.

Alcune condizioni patologiche richiedono, per la diagnosi, l’utilizzo di microscopi in grado di ottenere immagini ad alto ingrandimento ed alta risoluzione. Un esempio sono le malattie renali (glomerulo nefriti), polmonari (asbestosi) e forme particolarmente aggressive di cancro caratterizzate dalla perdita delle normali proteine. In questi casi può essere pertanto utile l’utilizzo di un microscopio molto potente chiamato “microscopio elettronico”. Questo tipo di microscopio utilizza un “fascio di elettroni” con il quale “bombarda” il tessuto consentendo la creazione di immagini in bianco e nero ad alta risoluzione. Il suo potere di ingrandimento raggiunge di 2 milioni di volte, rispetto alle 2000 del microscopio ottico normale.

I recenti progressi tecnologici hanno permesso agli anatomo-patologi di utilizzare i tessuti paraffinati in molti modi innovativi. Alcune aree specifiche dei tessuti possono essere rimosse tramite “micro-dissezione” ed analizzate tramite spettrometria di massa o altre tecniche.

Spesso vengono eseguiti test genetici, che coinvolgono lo studio dei cromosomi e del DNA eseguiti sia dagli anatomo-patologi che nei laboratori di patologia clinica. Si tratta di strumenti spesso molto utili, perlopiù per la diagnosi di patologie caratterizzate dalla presenza di anomalie genetiche.

Tra le anomalie genetiche rilevabili vi sono le anomali cromosomiche come la traslocazione (migrazione di porzioni di cromosomi in cromosomi differenti) o la delezione (perdita di porzioni di cromosomi); queste sono di solito evidenziate tramite una tecnologia nota come ibridazione fluorescente in situ (FISH). Il DNA e l'RNA isolati a partire dai campioni bioptici fissati, possono anche essere utilizzati per ricercare specifiche mutazioni o effettuare uno screening di alcune anomali genetiche.

Questo tipo di studi vengono attualmente eseguiti tramite una metodica nota con il nome “next generation sequencing” che prevede l’amplificazione simultanea di tantissimi piccoli frammenti di DNA ricomposti tramite un algoritmo per la determinazione del genoma.

Attualmente, vengono utilizzate molte tecniche molecolari nella diagnosi e classificazione di tumori maligni, come:

• Carcinoma mammario – HER2/neu
• Adenocarcinoma polmonare – EGFR
• Cancro del colon – KRAS
• Carcinoma ovarico e mammario – BRCA 1 e 2
• Melanoma – BRAF
• Neoplasia mieloproliferativa – JAK2
   

Per maggiori dettagli si rimanda alla pagina “Test genetici per la terapia mirata dei tumori”.

Riguarda l'analisi delle cellule rilasciate dall’esfoliazione delle superfici dell’organismo. Il Pap test è l'esempio più comune, ma sono frequentemente esaminati anche campioni con cellule di sfaldamento della vescica, della cavità addominale, della cavità toracica, del liquido cefalorachidiano e dei lavaggi polmonari.

Tramite l’agoaspirato possono essere raccolti campioni di fluidi biologici contenenti molte cellule (come il liquido pleurico che circonda i polmoni) o piccoli pezzi di tessuto. L’agoaspirato prevede l’utilizzo di una metodica simile a quella utilizzata per l’esecuzione della biopsia, ma tramite l’uso di un ago più fine. In genere tramite questa metodica viene prelevato un campione piuttosto liquido ed è particolarmente utile per la ricerca di cellule anomale.

L’analisi delle cellule ottenute da una grande massa o da un organo è più complicata; il processo può richiedere l’ausilio di tecniche di diagnostica per immagini per verificare il corretto prelievo del campione in corrispondenza della sede della lesione da analizzare. Sebbene infatti questa metodica venga spesso utilizzata per prelevare masse palpabili come cisti o linfonodi, può essere utilizzata anche per prelevare campioni siti in aree più interne e più difficilmente raggiungibili.

Il materiale ottenuto viene analizzato da un anatomo-patologo alla ricerca di informazioni utili per la formulazione delle diagnosi o per definire la necessità di altri approfondimenti diagnostici. Questa metodica consente di limitare gli effetti collaterali della biopsia, utilizzando anestetici locali e rendendo la diagnosi più veloce.

Le cellule prelevate dai liquidi corporei o dai tessuti possono essere analizzate tramite l’ausilio di un citofluorimetro, spesso utilizzato nella diagnosi di tumori come leucemie e linfomi. Tramite un complesso sistema di fluidiche, le cellule vengono fatte passare una ad una davanti ad un raggio UV. La quantità di luce diffratta e riflessa dalle cellule fornisce informazioni riguardanti rispettivamente le dimensioni e la complessità cellulare. L’utilizzo di anticorpi marcati con coloranti fluorescenti consente poi di raccogliere informazioni riguardanti altre caratteristiche delle cellule, perlopiù la presenza o l’assenza di proteine espresse sulla superficie delle cellule.